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藍(lán)藻藻華快速監(jiān)測技術(shù)解析

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工程師：王珊珊

藍(lán)藻藻華及其危害
隨著人類活動(dòng)強(qiáng)度的加劇，大量的氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)通過各種途徑進(jìn)入河流、湖泊、海洋等水體，造成水體富營養(yǎng)狀態(tài)。有研究表明：我國目前66%以上的湖泊、水庫處于富營養(yǎng)化水平，其中22%處于重富營養(yǎng)和超富營養(yǎng)狀態(tài)（陳小峰等, 2014; 胡利靜等, 2015）。與富營養(yǎng)化伴生的一個(gè)生態(tài)災(zāi)害現(xiàn)象是浮游植物藻華的大面積爆發(fā)（Farrow et al., 2020）。不同浮游植物類群形成的藻華會(huì)導(dǎo)致水體呈現(xiàn)出藍(lán)色、紅色、綠色、乳白色等不同的顏色，甚至有些物種會(huì)聚集形成絲狀體或片狀體，大面積的漂浮在水體表面，引發(fā)水體缺氧等一系列環(huán)境問題，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致魚類和其他水生生物的大量死亡（孔繁翔和高光, 2005; 王志剛, 2008; 莫婉湫等, 2009）。因此，水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象以及由此形成的藻華災(zāi)害已經(jīng)成為我國湖泊目前與今后相當(dāng)長一段時(shí)期內(nèi)的重大環(huán)境問題。
在各種藻華中，藍(lán)藻藻華發(fā)生的范圍*廣、危害*大，對人體健康會(huì)造成較大的傷害，在世界各地及我國均有大量的報(bào)道（肖興富等, 2005; 胡傳林等, 2010; 李晟銘等, 2019）。藍(lán)藻門（Cyanophyta）與其他真核藻類門中的物種有明顯的區(qū)別：藍(lán)藻細(xì)胞沒有完整的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，沒有核膜、核仁，僅有核質(zhì)聚集在細(xì)胞的中央?yún)^(qū)，被稱為原核細(xì)胞；沒有色素體等細(xì)胞器，通過分散在“核區(qū)”以外原生質(zhì)內(nèi)的色素進(jìn)行光合作用，藻體結(jié)構(gòu)簡單，單細(xì)胞藻體，各式群體和絲狀體；生活史中沒有有性生殖和具有鞭毛的生殖細(xì)胞（錢樹本等, 2005）。藍(lán)藻分布十分廣泛，遍布世界各地，但大多數(shù)物種是淡水的，海生的物種較少。
在世界范圍內(nèi)，藍(lán)藻藻華發(fā)生的頻率與規(guī)模都呈現(xiàn)出迅猛的增長趨勢（陳雋, 2006）。在我國，不僅有許多富營養(yǎng)型的湖泊如太湖、巢湖、滇池等連年發(fā)生藍(lán)藻藻華，甚至在一些流速較大的河流中如錢塘江、漢江等也有藍(lán)藻藻華事件的發(fā)生（陸開宏, 2009）。發(fā)生在無錫的水污染事件就是因?yàn)樗吹馗浇{(lán)藻大量堆積，厭氧分解過程中產(chǎn)生了大量的氨氣、硫醇、硫醚以及硫化氫等異味化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致（路云霞等, 2008; 楊銘威等, 2009）。如圖1 所示：N、P元素增多使得藍(lán)藻藻華爆發(fā)，藍(lán)藻的大量繁殖消耗了水體中大量的溶解氧，進(jìn)而使得生活在水體中的其他水生生物（魚類等）大量死亡，水質(zhì)惡化，而魚類等死亡水生生物的骨架腐爛、分解又釋放出來大量的N、P營養(yǎng)鹽，形成了一個(gè)惡性循環(huán)。在許多情況下，藍(lán)藻可以在短時(shí)間內(nèi)以極快的速度生長，故藻華發(fā)生的速度非?？?，給環(huán)境監(jiān)測與預(yù)警預(yù)報(bào)帶來了很大的困難。

圖1 藍(lán)藻藻華爆發(fā)機(jī)理圖
鑒定藍(lán)藻的技術(shù)手段
藍(lán)藻藻華具有重大危害，但目前還缺少有效的治理手段。雖然有很多物理、化學(xué)和生物技術(shù)可以直接沉降或殺死形成藻華的藍(lán)藻細(xì)胞，或直接撈取大量聚集的藍(lán)藻，避免藍(lán)藻對水質(zhì)的影響，但其所花費(fèi)的人力物力十分巨大，且很難完全控制藍(lán)藻藻華對水質(zhì)產(chǎn)生的影響。因此，必須建立一個(gè)藍(lán)藻藻華監(jiān)測系統(tǒng)，以便環(huán)境管理部門提前采取技術(shù)措施，減少其帶來的影響。以供水為例，如果能提前數(shù)小時(shí)預(yù)測到藍(lán)藻藻華將在取水口聚集降解，就有足夠時(shí)間，及時(shí)采取包括水源水的調(diào)度和制水工藝的改進(jìn)與強(qiáng)化等措施，減少藍(lán)藻藻華帶來的生態(tài)危害和健康風(fēng)險(xiǎn)，避免發(fā)生供水危機(jī)，保障供水安全（王志剛, 2008; 孔繁翔等, 2009）。
建立一個(gè)有效的藍(lán)藻藻華爆發(fā)預(yù)警系統(tǒng)需要解決以下幾個(gè)問題：
1) 監(jiān)測水體中是否存在藍(lán)藻?
2) 藍(lán)藻細(xì)胞的數(shù)量是多少?
3) 這些藍(lán)藻是否為有毒物種?
4) 藍(lán)藻毒素的濃度是多少？
5) 如何提前知道是否有問題?
藍(lán)藻群落的監(jiān)測內(nèi)容主要是種類（是否含有有毒物種）與生物量（物種濃度是否超標(biāo)）。傳統(tǒng)的監(jiān)測方法主要為人工鑒定，利用光學(xué)顯微鏡直接觀測藻類以獲得所需數(shù)據(jù)。通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行藻類鑒定至今仍是一種重要的技術(shù)手段，對于體積較大、具有特征形態(tài)，便于區(qū)分的藻類，顯微鏡鏡檢已成為**方法。但是，顯微鏡觀察需要復(fù)雜的人工操作和專業(yè)的生物學(xué)分類知識，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，易因觀察者的主觀判斷造成誤差，不能及時(shí)準(zhǔn)確地反映水體污染狀況，且不能進(jìn)行原位實(shí)時(shí)監(jiān)測，難以滿足種群動(dòng)力學(xué)觀測量大、連續(xù)的要求，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。另外，一些物種具有相似的形態(tài)學(xué)特征，在光學(xué)顯微鏡下很難分辨出來，可能需要借助電子顯微鏡，但檢測速度更慢，更難適用于大量樣品。
隨著光學(xué)儀器的發(fā)展，高效液相色譜儀、流式細(xì)胞儀已成為藻類多樣性分析的主要技術(shù)手段。通過分析藻類的細(xì)胞色素特征，可以得到定性及定量的結(jié)果，效率遠(yuǎn)高于形態(tài)學(xué)鏡檢。隨著分子水平研究的迅猛發(fā)展，使得DNA分子鑒定方法逐漸成為一種新的藻類多樣性研究方法，其準(zhǔn)確性方面都有著較大的優(yōu)勢。分子鑒定方法，首先需要選取被鑒定物種所含有的標(biāo)記基因，通過DNA 測序進(jìn)行序列的相似度比對，進(jìn)而分析被檢測類群的多樣性。以上這些方法雖然誕生時(shí)間不同、發(fā)展速度差異較大，但具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，需要根據(jù)目標(biāo)藻類的特征進(jìn)行合理的選擇。表1列舉了常見藻類鑒定分析的技術(shù)及其特點(diǎn)（Trask et al., 2005; Lomas et al., 2011; 錢奎梅等, 2015; 孟溪, 2019）。
表1 藻類鑒定分析常用方法
技術(shù)方法    應(yīng)用方面    測量速度    優(yōu)點(diǎn)    缺點(diǎn)
鏡檢    樣品少、直接計(jì)數(shù)    慢    準(zhǔn)確度高且能較為全面地反映樣品的種類分布    耗時(shí)耗力；需有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員；水樣中的非藻顆粒會(huì)造成干擾
高效液相色譜    樣品多    慢    準(zhǔn)確、便捷；可以確定藻類群落的組成和豐度    需前處理；受胞內(nèi)物組成限制；藻類特征色素基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)還比較缺乏
流式細(xì)胞儀    樣品多，直接計(jì)數(shù)    快    操作時(shí)間短，能靈敏檢測細(xì)胞死、活狀態(tài)    儀器昂貴；適用于小型細(xì)胞；鑒定水平低
分子鑒定    少量樣品    慢    準(zhǔn)確度高    過程繁瑣，需要測序及PCR過程
FlowCam的優(yōu)勢
流式影像儀（Flow Cytometer and Microscope , FlowCam）將流式細(xì)胞技術(shù)、顯微成像技術(shù)和圖像采集技術(shù)相結(jié)合，具有連續(xù)成像和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)的功能。因此，相比其他的技術(shù)手段，F(xiàn)lowCam具有自己獨(dú)特的優(yōu)勢，主要包括：
1) 快速計(jì)數(shù)；
2) 高速顯示數(shù)字化的生物體圖像；
3) 多參數(shù)分析；
4) 建立圖像庫，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)分類；
5) 較好的區(qū)分生命體和非生命體；
6) 現(xiàn)場檢測。
FlowCam的應(yīng)用案例
（1）綜合監(jiān)測
    美國的一家飲用水機(jī)構(gòu)為保證其用水安全，提出了一個(gè)綜合監(jiān)測藍(lán)藻細(xì)胞的方法，如圖2所示。首先，我們需要對水體中的藍(lán)藻細(xì)胞進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)。減少樣品測量時(shí)間的同時(shí)還要保證測量的準(zhǔn)確性，**測量浮游生物的體型和豐度是評估和表征許多重要指標(biāo)的必要手段。一些學(xué)者對FlowCam的準(zhǔn)確性進(jìn)行了對比試驗(yàn)，如侯建軍等（2004）對實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的3種純種赤潮藻進(jìn)行了不同計(jì)數(shù)方法（庫爾特計(jì)數(shù)法、FlowCam計(jì)數(shù)法、可見分光度法計(jì)數(shù)法、顯微鏡計(jì)數(shù)法）的比較研究，發(fā)現(xiàn)FlowCam在純種細(xì)胞計(jì)數(shù)方面有明顯的優(yōu)勢，是比較簡便、快捷、可行的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，且能人為分辨出細(xì)胞生長后期的細(xì)胞碎片甚至是死細(xì)胞。而準(zhǔn)確計(jì)數(shù)微囊藻和魚腥藻等群體型和絲狀型藍(lán)藻細(xì)胞對監(jiān)測潛在的有毒藍(lán)藻至關(guān)重要。Lehman等（2017）準(zhǔn)確計(jì)算了含有群體型微囊藻和絲狀型魚腥藻樣品的細(xì)胞密度。
當(dāng)FlowCam檢測到樣品中微囊藻、魚腥藻和顫藻（這三種藍(lán)藻均產(chǎn)生毒素）濃度較高時(shí)，需對樣品進(jìn)行qPCR檢測，以確認(rèn)樣本中的藍(lán)藻菌是否有產(chǎn)生毒素的基因。樣本中有微囊藻細(xì)胞并不意味著就會(huì)有毒素的產(chǎn)生。如果產(chǎn)生毒素的基因不存在，或者沒有被激活，那么微囊藻毒素就不會(huì)存在。如果qPCR結(jié)果是陽性，存在產(chǎn)毒基因，之后要利用LC-MS/MS（液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀）對樣品進(jìn)行毒素檢測，分析樣品中毒素的濃度是否達(dá)到監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)。LC-MS/MS分析樣品成本較高，因此FlowCam數(shù)據(jù)和qPCR檢測結(jié)果聯(lián)合使用，以證明或放棄毒素檢測。
    同時(shí)利用GC-MS（氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀）來監(jiān)測飲用水中引起人類感官不悅的兩種典型嗅味物質(zhì)：MIB（二甲基異茨醇）和GSM（土臭素）。一般認(rèn)為GSM隨著魚腥藻數(shù)目的增加而增加。因此，當(dāng)FlowCam計(jì)數(shù)魚腥藻細(xì)胞超過200個(gè)/ mL時(shí)，則表明嗅味事件可能已迫在眉睫。當(dāng)GC-MS結(jié)果確認(rèn)存在嗅味物質(zhì)時(shí)，便開始用PAC（粉末活性炭）處理，以去除MIB和GSM。

圖2  監(jiān)測有毒藍(lán)藻的流程圖
（2）治理檢測
現(xiàn)有的除藻方法有化學(xué)除藻法、生物除藻法和物理除藻法?；瘜W(xué)除藻法是利用化學(xué)試劑對藻類進(jìn)行殺除，但化學(xué)試劑處理過程中，可能會(huì)使藍(lán)藻細(xì)胞的降解，進(jìn)而導(dǎo)致有毒物質(zhì)（微囊藻毒素等）、惡臭代謝物（MIB、GSM）等釋放到水體中，造成環(huán)境的二次污染，使水質(zhì)環(huán)境形成惡性循環(huán)（孔繁翔等, 2009）。Jason等（2005）利用FlowCam結(jié)合葉綠素a分析化學(xué)除藻法對水體中藍(lán)藻細(xì)胞的破壞或溶解能力。通過熒光粒子濃度和葉綠素a分析，將葉綠素a的損失量化為細(xì)胞損傷。FlowCam拍攝的圖像為細(xì)胞損傷提供了定性觀察，可以更好的了解細(xì)胞損傷中裂解的風(fēng)險(xiǎn)。
生物除藻法主要通過水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈關(guān)系，即利用水中浮游動(dòng)物和魚類對水華藻類的攝食，改變生物群落結(jié)構(gòu)，增加對藻華藻量的控制能力。生物除藻法不會(huì)對環(huán)境造成二次污染，但是極易造成外來物種入侵，進(jìn)而對整個(gè)生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)造成嚴(yán)重破壞。因此，需要找到合適的臨界值，才能達(dá)到較好的控制效果。Ide等（2007）通過與傳統(tǒng)顯微鏡分析的比較，探討了使用FlowCam快速分析橈足類攝食的有效性和可靠性。結(jié)果表明，用FlowCam估計(jì)的橈足類動(dòng)物的攝食率與用顯微鏡觀察浮游動(dòng)物的攝食率是一致的；從顆粒的體積特異性熒光強(qiáng)度上，F(xiàn)lowCam成功地區(qū)分了浮游動(dòng)物和浮游植物，且用時(shí)較少不到顯微計(jì)數(shù)所需時(shí)間的十分之一。因此，未來我們也可以通過FlowCam來探究鰱魚等生物進(jìn)食藍(lán)藻的速率，進(jìn)而估算其控制藻華所需要的數(shù)量。
物理除藻法不會(huì)造成二次污染和生物入侵，但技術(shù)成本高、操作環(huán)境差。隨著超聲波技術(shù)的發(fā)展，將超聲波用于除藻抑藻方面的研究日益增多。超聲波除藻技術(shù)以其清潔、高效、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，在藍(lán)藻藻華控制領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。2015年夏天，新澤西州的一個(gè)飲用水處理設(shè)備進(jìn)行了一項(xiàng)研究，在超聲波浮標(biāo)測試中使用了FlowCam來幫助識別物種，并通過計(jì)數(shù)細(xì)胞和測量生物體積來監(jiān)測浮標(biāo)對藍(lán)藻藻華控制的效果。
結(jié)論
FlowCam實(shí)現(xiàn)了藻類細(xì)胞的快速檢測與自動(dòng)分類，減少了人工操作，不但能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行樣品分析，還可以在野外進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，且系統(tǒng)維護(hù)相對簡單，具有較高的實(shí)用性，*有可能實(shí)現(xiàn)有害藻類早期預(yù)警的技術(shù)方法，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)逐步探索形成標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)測方法，在湖泊、海洋等生態(tài)系統(tǒng)的研究中開拓更廣闊的領(lǐng)域。
雖然FlowCam已經(jīng)獲得廣泛應(yīng)用，但是在技術(shù)上仍存在一些不足，自動(dòng)分類仍然需要人工操作的輔助。FlowCam主要是根據(jù)細(xì)胞大小及色素差異對一些特定類群藻類進(jìn)行識別，對于室內(nèi)培養(yǎng)的純種藻分類效果較好，而野外樣品要復(fù)雜的多。一方面，赤潮藻細(xì)胞種類繁多，許多不同種類的浮游藻在形態(tài)學(xué)上極為相似；另一方面，同一種類的藻細(xì)胞在不同生長時(shí)期以及不同視點(diǎn)所獲取的圖像又可能在形態(tài)上具有差異性，這就使得自動(dòng)識別工作非常困難；加之由于技術(shù)的限制，通常獲得的圖像分辨率較差，更在一定程度上影響了識別的準(zhǔn)確度。當(dāng)FlowCam應(yīng)用于其他淺水湖泊時(shí)，需要使用者根據(jù)實(shí)際情況建立適用于該水體的藻類信息數(shù)據(jù)庫，方可實(shí)現(xiàn)部分藻類的自動(dòng)分類。
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